رنگ آمیزی بافت های گیاهی به دو منظور انجام می شود :

۱.پدیدار ساختن قسمت هایی که در حالت عادی شفاف و نامرئی هستند.

2. مشخص کردن یک جز از اجزای دیگر.

ثابت کننده ها :

مواد رنگی هم در واقع شامل ترکیباتی هستند که درون اجزای مقطع و سلول ها نفوذ می کنند و چون انواعی از آنها از لحاظ شیمیایی نیز واکنش هایی با اجزای سلول ها و مقاطع انجام می دهند ، تاثیری دائمی بر مقاطع می گذارند برای رنگ آمیزی بافت های قبل از مقطع گیری اندام مورد مطالعه را در محلول های ثابت کننده بیندازید . این محلول ها سلول های زنده را می کشد در نتیجه قابلیت نفوذپذیری دیواره سلولی در برابر رنگ ها افزایش می یابد و در عین حال مواد ثابت کننده باعث می شوند که اجزای سلولی به همان شکل ساختمانی که در حالت زنده داشته باقی بمانند . یکی از ثابت کننده های مهم الکل است . اندام مورد نظر را به مدت ۲۴ ساعت در الکل اتیلیک یا الکل متیلیک قرار دهید که در این صورت الکل آب اندام ها را گرفته و آنها را برای مقطع گیری آماده می کند .

انواع رنگ آمیزی :

رنگ آميزي ساده: انجام رنگ آمیزی به وسیله یک رنگ

رنگ آميزي مضاعف: انجام رنگ آمیزی به وسیله دو نوع رنگ

رنگ آمیزی ساده:

در اين روش كه به منظور مطالعه چگونگي وضع يك نوع بافت بكار مي رود برش تهيه شده را پس از بيرنگ كردن با آب ژاول به مدت نیم تا یک دقیقه در محلول يك رنگ ساده مي گذارند.ونوع بافت مورد نظر را با توجه به رنگي كه گرفته است تشخيص مي دهند. مثلاً بافت هاي چوبي يا چوب پنبه و کوتین با محلول رقیق بلودو متیلن به رنگ آبی در مي آيدو بر دیواره سلولزی سلول ها اثر ندارد وبافت هاي سلولزي بامحلول قرمز كنگو به رنگ قرمز در مي آيند.

رنگ آمیزی مضاعف يا مرکب:

در اين روش ابتدا برش ها را در يك محلول رنگ كننده بافت چوبي وچوب پنبه اي مانند آبي متيل ،سبز متيل يا فوشين قرار مي دهند وسپس آن ها را با يك محلول رنگ كننده با فت سلولزي مانند كارمن زاجي يا قهوه اي بيسمارك يا قرمز كنگو رنگ مي كنند. رنگ آميزي مضاعف چند نوع است كه متداول ترين روش آن در ادامه خواهد آمد.

طرز تهيه آب ژاول

در آزمايشگاه جهت بيرنگ كردن بافتهاي گياهي و يا جانوري از آب ژاول استفاده ميشود . اما ميتوانيد از آب ژاول تجاري ( وايتكس ) كه به نسبت يك به پنج رقيق شده است، استفاده كنيد . براي تهيه آب ژاول به شيوه زير عمل ميكنيم :

40 گــرم كلروردشو (Ca(Clo)₂ + Cacl₂) و 20 گرم كربنــات سديم در يك ليتــر آب مقطر كه به مدت 10 دقيقه در دماي 50 الي 60 درجه سانتيگراد حرارت داده ميشود . سپس محلول بدست آمده را صاف ميكنيم.

H₂O + Ca(Clo)₂ + Cacl₂ + 2Na₂Co₃   ——–>           2Naclo + 2Nacl + 2Caco₃

طرز تهيه محلول لوگل يا يد يدوره

5/0 گرم يد فلزي با 1 گرم يدور پتاسيم در 100 سي سي آب مقطر ، محلول لوگل بدست مي آيد . كه يكي از معرفهاي رنگي دانه نشاسته است و آنرا به رنگ آبي تا بنفش در مي آورد.

I₂ + IK + H₂O                  محلول لوگل

طرز تهيه محلول كارمن زاجي  

1 گرم پودر كارمن با 5 گرم زاج سفيد (KAL(SO₄)₂.12H₂O) در 100 سي سي آب مقطر كه به مدت 30 دقيقه مي جوشانيم حاصل ميشود سپس بعد از 24 ساعت محلول حاصل را صاف كرده و به آن 5/0 گرم اسيد فنيك جهت جلوگيري از كپك زدن اضافه ميكنيم .

طرز تهيه محلول متيلن آبي

1 گرم پودر وردومتيل را در 1 ليتر آب مقطر حل مينمائيم .

شرح آزمايش رنگ آمیزی 1:

مواد و وسایل لازم :

۱. دو عدد شیشه ساعت

۲. آب مقطر

3.بلو دو متیلن ، سبزید یا فوشین آمونیاکی

4.تیغ برای مقطع گیری

دستور کار رنگ آميزي :

۱.قرار دادن مقاطع در شیشه ساعت حاوی محلول رقيق بلودومتیلن به مدت نیم تا یک دقیقه

۲. شست و شو مقاطع باآب

توجه :

برای رنگ آمیزی با سبزید مقاطع را به مدت یک دقیقه در محلول سبزید5/0 درصد برای رنگ آمیزی با فوشین آمونیاکی مقاطع را به مدت چند ثانیه در محلول فوشین آمونیاکی قرار داده وسپس شستشو مي دهيم

نتیجه آزمایش :

۱. بلودومتیلن چوب ، چوب پنبه و کوتین را آبی رنگ و بر دیواره های سلولزی سلول ها اثري ندارد .

۲. سبزید بافت های چوب ، چوب پنبه و کوتین را به رنگ سبز متمایل به آبی در می آورد .

۳. فوشین آمونیاکی بافت های چوب ، چوب پنبه و کوتین را به رنگ قرمز در می آورد .

شرح آزمایش رنگ آمیزی 2 : روش کار و نتایج مهم !!!

مواد و وسایل لازم :

۱. نه عدد شیشه ساعت

۲. یک عدد تیغ برای مقطع گیری

۳. آب مقطر

۴. آب ژاول

۵. اسید استیک

۶. آبی متیل یا سبزید یا فوشین آمونیاکی (برای تشخیص بافت های چوبی و چوب پنبه ای)

۷. کارمن زاجی (برای تشخیص بافت های سلولزی)

دستورکاررنگ آميزي :

در این نوع رنگ آمیزی دو دسته اصلی بافت ها (بافت های چوبی و سلولزی) از هم متمایز می شوند که برای این کار از دو رنگ استفاده می شود که یکی سلولز و دیگری چوب ، چوب پنبه و کوتین را رنگ آمیزی می کند

مراحل رنگ آمیزی مضاعف:

۱. قرار دادن مقاطع میکروسکوپی (برش ها) در آب ژاول به مدت ۲۰- ۱۵ دقیقه

2.شستشو مقاطع با آب مقطر

۳. قرار دادن مقاطع در اسید استیک ۱% به مدت ۲- ۱ دقیقه

۴. شستشو مقاطع با آب مقطر

۵.قرار دادن مقاطع در محلول سبزید یا آبی متیل به مدت20 ثانیه

۶. شستشو مقاطع با آب مقطر

۷. قرار دادن مقاطع در محلول کارمن زاجی به مدت 20- 15 دقیقه

۸.شستشو مقاطع با آب مقطر

نتیجه آزمایش :

۱. سلول های دارای دیواره سلولزی مانند پارانشیم ، کلانشیم ، آوندهای آبکشی و فیبر سلولزی به وسیله کارمن زاجي به رنگ قرمز متمایل به نارنجی در می آيند .

۲. بافت های چوبی ، چوب پنبه ای و کوتینی توسط سبزید یا آبی متیل به رنگ سبز یا آبی متمایل به سبز در می آیند .

توجه:

– علت قرار دادن برش هادر آب ژاول از آن جهت انجام مي شود كه از خاصيت رنگ بري اين ماده استفاده شود تا نور بتواند از بافت هاي رنگي نمونه عبور كند.

– چون این ماده دارای خاصیت قلیائی بوده برای رفع این مشکل ( خنثی کردن اثر آب ژاول) برش ها را به مدت ۲ الی ۳ دقیقه در اسید استيك می خوابانیم.

– از مرحله اول تا انتهای مرحله پنجم رنگ آمیزی ساده و از مرحله اول تا انتهای مرحله هفتم رنگ آمیزی مضاعف نامیده میشود .